PRODUKSI LIPASE DARI MIKROBA HASIL ISOLASI
Disusun Oleh:
Nama : Nurhesti Febriyani
NIM : B1J008039
Rombongan : I
Kelompok : 2
Asisten : Nesty Dwiyani S. P.
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI INDUSTRI
KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2011
PENDAHULUAN
I. Latar Belakang
Dewasa ini teknologi enzim banyak dikembangkan dan mendapat perhatian, karena dapat diaplilkasikan dalam berbagai bidang industri baik industri pangan maupun non pangan. Salah satu jenis enzim yang dapat diaplikasikan dalam industri adalah enzim lipase. Enzim tersebut mampu menghidrolisis ester pada bidang antara minyak- air dalam substrat yang tidak larut air atau sistem yang heterogen (Reed, 1984).
Sumber enzim lipase dapat diperoleh dari berbagai jenis mikrobia seperti misalnya jamur dan bakteri (Crueger and Crueger, 1989). Enzim yang berasal dari jenis mikroba tersebut secara komersial banyak digunakan dalam industri minyak dan lemak, detergen, kosmetik dan industri penyamakan kulit. Didalam industri penyamakan kulit, enzim lipase diperlukan dalam proses penghilangan lemak untuk menurunkan kadar lemak atau minyak alami kulit (Addy, 1994).
Penelitian isolasi enzim lipase yang berasal dari mikroba pertama kali dilakukan oleh Alford dan Pierce (1961) dengan mengisolasi jamur berwarna putih yang tumbuh di permukaan cheese dan sour cream (Brockerhoff and Jensen, 1974). Enzim yang dihasilkan mampu digunakan untuk reaksi lipolisis minyak atau lemak dari produk-produk susu dan enzim tersebut dihasilkan secara ekstraselular dalam media cair pepton broth.
Produksi enzim lipase yang berasal dari mikroba dapat dikerjakan dengan fermentasi menggunakan substrat cair. Selama proses fermentasi produknya dipengaruhi oleh faktor genetik dan faktor lingkungan. Faktor lingkungan yang mempengaruhi produksi enzim yaitu media, mineral, induser, suhu, pH, tingkat aerasi (oksigen) dan fase pertumbuhan. Media yang digunakan umumnya mengandung senyawa-senyawa sebagai sumber karbon (C), nitrogen (N), dan beberapa senyawa sebagai faktor tumbuh dan sebagai induser (Rehm and Reed, 1985).
II. Tujuan
Tujuan praktikum ini adalah untuk mengetahui proses produksi enzim lipase oleh mikroba dan untuk mengetahui pengaruh dari perubahan suhu terhadap aktifitas enzim lipase.
MATERI DAN METODE
I. Materi
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah cawan petri, pipet ukur, jarum inokulasi, pembakar spirtus, erlenmeyer, tabung reaksi, uv cabinet, inkubator, sheker inkubator, pipet ukur, mikroskop, haemocytometer, botol UC dan sperey alkohol.
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah tanah sawah, tanah TPA, pasir, tanah peternakan, kotoran sapi, air got, air limbah tahu, akuades steril, media NA, media NB, media SA, media SMA, media Rhodamine B agar, media Pycopskaya, media Cytophage, NaOH 0,05 N, phenolphtslien 1%, alkohol, gum arab dan oleve oil.
II. Metode
1. Skrining
ü Dibuat konsorsium dengan mencampurkan berbagai sampel dari masing-masing kelompok 3 gr/ 3 ml didapat 24 gr sampel.
ü Dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-9 sehingga didapat total keseluruhan 216 ml dengan perbandingan sampel:akuades (1:9)
ü Diambil konsorsium 10 ml dituangkan ke dalam tabung reaksi.
ü Dipleting ke dalam media yang telah disediakan (SA, SMA, RA, Pk dan Cy) dengan streak continyu diputar 180°.
ü Diinkubasi selama 2 x 24 jam (30°C).
ü Diamati hasilnya.
2. Pembuatan Stok, Preparasi I dan Enumerasi
§ Pembuatan Stok
a. 1 ose diinokulasika pada media NA miring
§ Preparasi I dan Enumerasi
a. 1 ose diinokulasikan pada media NB 10 ml, diinkubasi 1 x 24 jam.
b. Dipindah ke media NB 100 ml, dihomogenkan, dan di shaker inkubator.
c. Setiap dua jam sekali dilakukan penghitungan jumlah sel dengan mengunakan alat bantu yaitu haemocytometer.
3. Preparasi II dan Produksi Lipase
Ø Preparasi II
a. Diambil 0,2 ml isolat dari stok.
b. Diinokulasikan pada media NB 10 ml inkubasi selama 6 jam.
Ø Produksi Lipase
a. Diambil 2 ml dari media NB 10 ml (preparasi II).
b. Diinokulasikan pada media NB 100 ml (media produksi minimum + oleve oil).
c. Diinkubasi di shaker inkubator 2 x 24 jam.
HASIL DAN PEMBAHASAN
I. Hasil
| TABEL 1. HASIL UJI SKRINING | |||||
| Kelompok | Media | ||||
| RA | SA | SMA | PK | Cy | |
| 1 | ⁺ | ⁺ | ⁺ | * | * |
| 2 | ⁺ | ⁺ | ⁺ | ─ | ⁺ |
| 3 | ⁺ | ─ | ⁺ | * | ─ |
| 4 | ─ | ⁺ | ⁺ | * | ─ |
| 5 | ⁺ | ⁺ | ⁺ | * | ⁺ |
| 6 | ⁺ | ⁺ | ⁺ | * | ⁺ |
| 7 | ⁺ | ⁺ | ⁺ | * | ─ |
| 8 | ⁺ | ⁺ | ⁺ | * | ⁺ |
| Keterangan | : | ⁺ | (ada koloni dan bersifat positif setelah dilakukan uji) | |||||
| ─ | (ada koloni dan bersifat negatif setelah dilakukan uji) | |||||||
| * | (tidak ada koloni) | |||||||
| TABEL 2. ENUMERASI PREPARASI INOKULUM | ||||||||
| Kelompok | Waktu | |||||||
| Jam Ke-0 (08.00) | Jam Ke-2 (10.00) | Jam Ke-4 (12.00) | Jam Ke- 6 (14.00) | |||||
| 1 | 5 x 10⁵ | 2,8 x 10⁶ | 1,4 x 10⁷ | 4,35 x 10⁷ | ||||
| 2 | 2,5 x 10⁵ | 5,3x 10⁶ | 9,3 x 10⁷ | 2,8 x 10⁸ | ||||
| 3 | 2,4 x 10⁶ | 5,6 x 10⁶ | 1,7 x 10⁷ | 1,62 x 10⁸ | ||||
| 4 | 8 x 10⁵ | 2,455x 10⁷ | 2,385 x 10⁶ | 2,395 x 10⁸ | ||||
| 5 | 3 x 10⁶ | 3,3 x 10⁷ | 4,3 x 10⁷ | 3,15 x 10⁶ | ||||
| 6 | 8,5 x 10⁵ | 1,2 x 10⁷ | 3,55 x 10⁷ | 5,7 x 10⁸ | ||||
| 7 | 4,5 x 10⁵ | 2,15x 10⁶ | 2,56 x 10⁸ | 4,61 x 10⁷ | ||||
| 8 | 8 x 10⁶ | 1,7 x 10⁷ | 1,3 x 10⁸ | 6,8 x 10⁸ | ||||
| SA (iodine) |
| SA |
| RA |
| SMA |
| Pk |
| Cy |
II. Pembahasan
Kemampuannya dalam menghidrolisis lemak, mono- dan di-gliserida yang akan menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol, dan sebaliknya pada kondisi tertentu lipase juga mengkatalisis reaksi sintesis gliserida dari gliserol dan asam lemak menjadikan lipase banyak digunakan dalam semua aktivitas produksi baik pangan dan non pangan. Aplikasinya banyak dijumpai antara lain pada industri makanan dan minuman, detergen, farmasi, agrokimia, oleokimia dan kosmetik (Salihu, et al., 2011).
Penggunaan lipase dalam industri makanan memiliki keunggulan karena hidrolisis yang dikatalisis bersifat spesifik. Modifikasi oleh enzim lipase yang memiliki spesifisitas reaksi 1,3-gliserida menghasilkan gliserida dengan produk utama diasilgliserol (DAG) dan produk sampingan monoasilgliserol (MAG) serta asam lemak bebas dan gliserol. Minyak yang kaya DAG dapat berfungsi sebagai minyak sehat karena antara lain dapat mengurangi trigliserida (TG) dalam serum darah, mencegah akumulasi lemak dalam tubuh (Purtanto dan Budiani, 2009).
Berbagai upaya untuk produksi lipase telah dikembangkan, termasuk eksplorasi dan skrining terhadap beberapa spesies secara intensif. Pendekatan produksi lipase yang umum dilakukan dan telah berkembang ketingkat komersialisasi adalah ekplorasi dan skrining strain secara intensif dengan rekayasa genetik. Eksplorasi dan skrining yang berpotensi tinggi sebagai penghasil lipase merupakan tahapan penting dalam rekayasa genetik produk lipase (Purtanto dan Budiani, 2009).
Media yang digunakan dalam identifikasi atau skrining lipase adalah media SA (Starch Agar), untuk menumbuhkan mikroba yang menghasilkan enzim amilase yang ditambah dengan larutan indikator logols iodine, tumbuhnya bakteri ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih di dekat bakteri tersebut. Media SMA (Skim Milk Agar), media untuk menumbuhkan mikroba yang mampu menghasilkan enzim protease, tumbuhnya bakteri ditunjukkan dengan adanya zona jernih. RA (Rhodamine Agar), media untuk menumbuhkan mikroba yang mampu menghasilkan enzim lipase, tumbuhnya bakteri ditunjukkan dengan adanya perpendaran. Cythopage merupakan media pelarut selulosa, indikator pewarna berupa Congo red. Pikovskaya merupakan media yang dapat memudahkan isolasi mikrobia pelarut fosfat (MPF) baik bakteri pelarut fosfat (BPF) maupun fungi pelarut fosfat (FPF). Zona jernih mencirikan bahwa bakteri tersebut mampu melarutkan fosfat dari bentuk kalsium fosfat yang digunakan dalam media Pikovskaya tersebut (Schuepp et al., 1997).
Hasil skrining yang didapat kelompok 2 untuk lima media beberapa menunjukan hasil positif dan ada juga yang negatif. Untuk praktikum lipase ini kami memfokuskan ke RA nya, media selektif yang digunakan untuk identifikasi mikroba penghasil lipase. Hasilnya dapat dilihat dengan menggunakan UV cabinet dengan panjang gelombang 320 nm dapat dilihat perpendaran warna yang dihasilkan oleh mikroba tersebut berwarna jingga atau orange cerah yang disebut zona fluoresens, hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Olivia, et al.(1998) dengan mengisolasi Rhizopus spp. perpendaran atau halo ini ditunjukan sebagai aktivitas antara enzim yang dihasilkan oleh isolat (asam lemak) denga Rhodamine agar (Tika, dkk., 2007).
Sampel yang digunakan adalah tanah sawah, limbah tahu atau tempe, tanah TPA, tanah kebun dan tanah kolam kemudian dibuat konsorsium dengan perbandingan sampel dan akuades 1:9, angka sembilan berasal dari pengenceran. Konsorsium mikroba adalah campuran dari berbagai macam mikroba yang memiliki suatu fungsi, salah satunya adalah menekan pertumbuhan mikroba patogen (Anonim, 2011). Untuk enumerasi atau penghitungan ini menggunakan alat bantu berupa haemocytometer, ini bertujuan untuk mengetahui fase eksponensial dari pertumbuhan mikroba penghasil lipase. Cara untuk mengetahui fase ini yaitu dengan menghitung jumlah sel menggunakan haemocytometer dengan menggunakan aturan L. perhitungan dengan kotak sedang yaitu (Verpoorte, 2000). Fase eksponensial terjadi pada jam ke-4 (pukul 12.00) dimana jumlah sel meningkat sangat tajam, hal ini menunjukkan bakteri tumbuh pada kecepatan yang maksimal (Iwai, 1984).
Fase eksponensial adalah periode dimana organisme tumbuh pada kecepatan mungkin maksimal yang diberikan potensi genetiknya, medium alami, kondisi dimana mereka tumbuh, populasi yang lebih seragam dalam hal kelengkapan kimia dan fisika selama periode ini (Voleskey, 1985).
Lipase merupaka hasil metabolit yaitu intermediet dan produk metabolisme untuk molekul kecil. Metabolit primer adalah hasil dari metabolisme primer seperti protein, karbohidrat, lemak yang digunakan sendiri oleh organisme tersebut untuk pertumbuhannya. Beberapa antibiotik digunakan sebagai prekursor metabolit primer, seperti actinotherapi yang diciptakan dari metabolit primer, tryptophan. Sebuah metabolit sekunder adalah tidak terlibat langsung dalam proses tersebut, tetapi biasanya memiliki fungsi ekologis penting. Contohnya termasuk antibiotik dan pigmen (Anonim, 2011). Tika, dkk. (2007) menambahkan, enzim lipase yang dihasilkan oleh bakteri biasanya dihasilkan pada seluruh fase kehidupan mikroorganisme. Enzim ini bersifat konstitutif artinya terus-menerus diekspresi tanpa membutuhkan induser, ekspresi enzim lipase meningkat saat mikroorganisme masuk fase kematian karena jumlah produk lemak dari sel-sel yang mati meningkat.
Media pertumbuhan yang digunakan adalah media produksi minimum yang diperoleh dari mengemulsikan gum arab dan olive oil yang merupakan sumber karbon dan nitrogen bagi produksi lipase (Salihu, et al., 2011). Tahapan pengujian aktivitas lipase tidak dilakukan karena ada kendala dari bahan yang digunakan untuk pengujian tersebut. untuk pengujian aktifitas lipase ini Sahuli, et al. (2011) mengunakan metode colorimetric. Dimana 1 ml isopropanol yang mengandung 3 mg paranitrofenil palmitat dicampurkan dengan 9 ml dari 0,05 M Tris-HCl pada pH 8.0, yag mengandung 40 mg Triton X-100 dan 10 mg gum arab.
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim lipase:
· Suhu
Suhu optimal lipase adalah 30-400C, aktivitas akan berkurang pada suhu dibawah 300C dan diatas 400C.
· pH
Lipase memiliki pH optimal 8-9, beberapa golongan dapat bekerja pada pH 4,1-6,3.
· Konsentrasi substrat
Jika konsentrasi substrat rendah maka semua substrat akan berikatan dengan enzim, jika konsentrasi substrat naik maka akan lebih banyak enzim yang berikatan dengan substrat. Semakin tinggi konsentrasi substrat tidak akan meningkatkan kecepatan reaksi.
· Konsentrasi enzim
Kecepatan aktivitas enzim berbanding lurus dengan konsentrasi enzim.
· Adanya aktivator
Beberapa ion dan molekul mempunyai kemampuan menonaktifkan enzim.
· Spesifisitas substrat
Lipase akan bekerja degan baik jika enzim menemukan substrat yang sesuai dengan karakteristik dan kemampuannya.
· Pelarut organik
Pelarut organik digunakan untuk melarutkan lemak agar pada suhu kamar ada pada keadaan cair, dalam menggunakan pelarut organik yang harus diperhatikan adalah jenis pelarutnya dan volumenya (Hameed, 2001).
Dua negara di kawasan Asia Tenggara yaitu Indonesia (Putranto dan Budiani, 2009) dan Malaysia (Salihu, et al., 2011) merupakan negara terbesar dunia yang menghasilkan minyak sawit, sehingga dalam hal ini mereka memerlukan peran dari aktivitas enzim salah satunya adalah lipase sebagai biokatalisi. Saxena, et al. (2003) menyebutkan ada beberapa mikroba penghasil lipase baik dari kelompok bakteri, fungi maupun yeast. Bakteri yang diketahui menghasilkan lipase adalah Pseudomonas, Staphylacoccus, Chromobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Propionibacterum dan Acinetobacter. Yeast yang menghasilakn lipase adalah Candida dan Trichosporon. Sedangkan untuk fungi adalah Pythium, Rhizopus, Mucor, Neurospora, Aspergillus, Penicillium dan masih banyak lagi.
PENUTUP
I. Kesimpulan
Dari pembahasan diatas dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:
1. Lipase merupaka enzim yang dapat menghidrolisi rantai panjang trigliserida menjadi asam lemak bebas dan gliserol. Lipase ini banyak digunakan dalam industri baik pangan dan non pangan.
2. Beberapa mikroba penghasil lipase adalah sebagai beriku: Bakteri yang banyak digunakan untuk produksi lipase adalah Pseudomonas, Staphylacoccus, Chromobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Propionibacterium, dan Acinetobacter. Yeast yang banyak digunakan untuk produksi lipase adalah Candida dan Trichosporon. Sedangkan untuk fungi adalah Pythium, Rhizopus, Mucor, Neurospora, Aspergilus, dan Penicillium.
3. Produksi enzim lipase adalah dengan mengunakan media slektif yang ditambahkan olive oil sebagai sumber karbo dan energi, yang sebelumnya di skrining terlebih dahulu pada media Rhodamine B agar.
II. Saran
Saran saya buat praktikum kali ini, waktunya jangan sampai lama, media yang digunakan jangan yang aneh-aneh dan untuk selanjutnya semoga pengukuran aktivitas lipase dapat dilakukan.
DAFTAR REFERENSI
Addy, V., 1994. The Future of Degreasing. The International of Leather and Publication. 12:32-33.
Brockerhoff, H. and Jensen, R. G. 1974. Lipolytic Enzymes. New York: Academic Press.
Crueger, W. and Crueger, A. 1989. Biotechnology. A Textbook of Industrial Microbiology. MA: Sinauer Associates, Inc. Sunderland.
Hasan, F. And Hameed, A. 2001. Optimization of Lipase Production from Bacillus sp. Microbiology Research Laboratory, Departement of Biological Sciences. Pakistan, Islamabad. Quaid-I-Azam University.
Iwai, M & Y. Tsujisaka. 1984. Fungal lipases. Dalam: Borgstrom, B. & H.L. Brockman (eds). Lipases. Elsevier Science Publishers. Amsterdam.
Olivia, F., Gunawan, A. W. dan Suwanto, A. 1998. Isolasi dan Deteksi Aktivitas Lipase Rhizopus spp. Jurusan Biologi MIPA IPB, Jalan Raya Pajajaran, Bogo,16144.
Putranto, R. A. dan Budiani, A. 2009. Isolasi fragmen gen LIPASE dari kapang Absidia corymbifera, Rhizopus oryzae dan Rhizopus oligosporus. Bogor: Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia.
Reed, G. 1984. Presscott and Dunn’s Industrial Microbiology. New York: Mc. Graw Hill.
Rehm, H.J. and Reed, G. 1985. Biotechnology. Enzyme Technology. Volume 7a.
Salihu, A. Alam, Md. Z. Abdulkarim, M. I. and Salleh, H. M. 2010. Suitability of Using palm oil mill effluent as a medium for lipase production. African Journal of Biotechnology Vol. 10(11). Nigeria: Ahmadu Bello University and Kuala Lumpur: International Islamic University.
Schuepp., S. Kermasha,. M.C. Michalski., A. Morin. 1997. Production, Partial Purification and Charac terisation of Lipases from Pseudomonas fragi.
Saxena, R. K., Sheoran, A., Giri, B. and Davidson, W. S. 2003. Purification strategies for microbial lipases. Journal of Microbiological Methods 52 (2003) 1 – 18. Department of Microbiology, University of Delhi South Campus, Benito Juarez Road, New Delhi 110021, India.
Tika, I. N., Redhana, I. W. dan Ristiati, N. P. 2001. Isolasi Enzim Lipase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang Kecamatan Gerogak, Buleleng Bali. Akta Kimindo Vol. 2 No. 2 April 2007: 109 – 112. Bali: IKIP Negeri Singaraja.
Verpoorte, A. W. Alfermann. 2000. Metabolic engineering of plant secondary metabolism. Springer.Page.1-3.
Voleskey. J.H.T. Luong. 1985. Microbial enzymes Production, Purification and Isolation.
