ISOLASI DAN IDENTIFIKASI Acetobacter sp.
Oleh:
Nama : Nurhesti Febriyani
NIM : B1J008039
Rombongan : 2
Kelompok : 5
Asisten : Ferry Frendy S.
LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI
KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2010
I. PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Bakteri asam asetat termasuk dalam family Acetobacteriaceae yang dikarakteristikkan oleh kemampuannya mengoksidasi etanol menjadi asam asetat. Bakteri-bakteri asam asetat mencakup genus-genus Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Glucanocetobacter, Gluconobacter, Kozakia, Swaminathania, dan Saccharibacter. Beberapa spesies Acetobacter kini dimasukkan dalam Glucanocetobacter karena diketahui mampu menghasilkan selulosa. Bakteri ini dapat diisolasi dari buah, bunga, makanan terfermentasi, minuman,vinegar maupun limbah (Hidayat,2010).
Asam asetat, asam etanoat atau asam cuka adalah senyawa kimia asam organik yang dikenal sebagai pemberi rasa asam dan aroma dalam makanan. Asam cuka memiliki rumus empiris C2H4O2. Rumus ini seringkali ditulis dalam bentuk CH3COOH, CH3COOH, atau CH3CO2H. Asam asetat murni (disebut asam asetat glasial) adalah cairan higroskopis tak berwarna, dan memiliki titik beku 16.7°C ( Lancaster, 2002).
Berbagai pendekatan yang dapat dilakukan untuk memperoleh mikroorganisme dari lingkungan adalah pendekatan shotgun dan pendekatan objective. Pendekatan shotgun yaitu sampel mikroorganisme dapat dikoleksi dari berbagai habitat seperti materi tanaman, hewan, tanah, limbah, aliran air, dan habitat buatan manusia. Pendekatan objective yaitu pengambilan sampel diarahkan pada tempat spesifik yang sesuai untuk kehidupan mikroorganisme tertentu. Isolat-isolat dengan sifat tertentu kemudian dipilih dan dipisahkan dari mikroorganisme tertentu. Teknik ini disebut isolasi. Isolasi yaitu suatu usaha untuk memisahkan suatu jenis mikroorganisme dari campurannya sehingga diperoleh kultur murni (Ryandini et al., 2005).
Karakterisasi terbagi dalam beberapa tahap yaitu klasifikasi dan identifikasi. Klasifikasi merupakan pengelompokan mikroba ke dalam kelompok. Teori identifikasi bakteri merupakan perbandingan antara yang tidak diketahui dan yang diketahui. Tingkat keakuratan dari identifikasi bergantung pada ketelitian kerja preparasi seperti pembuatan media, pembuatan reagen dan pewarnaan, dan ketelitian dalam melakukan, mengamati, dan menatat berbagai uji. Ketika suatu organisme tidak dapat diidentifikasi atau seperti spesies asing, kita dapat menduga mungkin kultur tersebut tidak murni, atau kita sudah membuat kesalahan (error) dalam observasi dan pencatatan. Identifikasi karakteristik suatu organisme dapat dilakukan dengan 2 metode pendekatan yaitu konvensional (mikrobiologis) dan pendekatan molekuler. Penetapan nama ilmiah internasional yang tepat terhadap mikroba didasarkan pada sistem penamaan ’Binomial Nomenklatur’ Carolus Linnaeus (Ketchum, 1984) .
Perbedaan antara karakterisasi untuk klasifikasi dan identifikasi tidak terletak pada banyaknya uji yang dilakukan, tetapi pada hasil dari uji tersebut. Pernyataan ini tidak sepenuhnya benar, karena kebanyakan taksonomi saat ini mendukung konsep yang menyatakan bahwa untuk klasifikasi, bobot yang sama harus diberikan terhadap masing-masing karakter atau ciri. Hubungan antar strain dapat dihitung dan diekspresikan sebagai kemiripan dari karakter pisitif (Ketchum, 1984), atau dengan menjumlahkan antara ciri-ciri yang positif dan yang negatif. Hasil dari perbandingan ini dapat dianalisa secara laborat melalui perhitungan atau lebih mudah dengan menggunakan komputerisasi. Namun, untuk tujuan identifikasi kita memberikan bobot yang tinggi untuk beberapa karakter karena mempunyai nilai perbedaan yang sangat besar, dan memberikan bobot yang kecil untuk yang lain, atau bahkan tidak samasekali untuk karakter tertentu.
Acetobacter sp. merupakan bakteri gram negatif yang termasuk dalam bakteri asam cuka (BAC). Habitat Acetobacter ini sangat luas dan beragam termasuk dalam lingkungan, dan berbagai produk fermentasi. Acetobacter sering dimanfaatkan dalam berbagai kegiatan industri (Tannock et al., 1999).
B. TUJUAN
Tujuan dari praktikum ini adalah mengisolasi dan mengidentifikasi Acetobacter sp. hasil isolasi dengan pendekatan mikrobiologis.
II. MATERI DAN METODE
A. MATERI
Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini adalah inkubator, jarum ose, tabung reaksi, cawan petri, pembakar spirtus, mikroskop, timbangan analitik, sprayer alkohol, pipet ukur, pipet tetes, filler, erlenmeyer, gelas ukur, label, gunting, kain kasa, kapas, wraper, gelas objek, tissue dan pisau.
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah buah nanas, air kelapa, gula, ZA, cuka, akuades, media indole, alkohol 70%, reagen tetramethy-D-phenylenediamine dihydrocloride, reagen H2O2, satu set pewarna Gram dan spirtus, media yaitu: media selektif HS “Herstin Schramm” dengan komposisi Glukosa 2%, Asam asetat 0,115%, Pepton 0,5%, Yeast extract 0,5%, Na2HPO4 0,27% dan MgSO47H2O 0,05%. Media YEPDA dengan komposisi Agar 20 gr/L, Yeast extract 5 gr/L, Pepton 10 gr/L dan Dextrose 20 gr/L. Media Carr dengan komposisi Yeast extract 30 gr/L, Agar 20 gr/L, Broomcresol green, etanol 20 ml, dan akuades 1000 ml. Media Frateur dengan komposisi Yeast extract 10 gr/L, Agar 20 gr/L, etanol 20 mL, CaCo3 20 gr/L dan Akuades 1000 mL. Dan media YEPDA semisolid komposisinya sama dengan Media YEPDA tetapi media ini ditambah akuades 1000 mL. Media SIMA dengan komposisi Tripton 20 gr, Peptone 6,1 gr, Akuades 1000 mL, Agar 3,5 gr, Sodium tiosulfat 0,2 gr dan Ferrous amonium sulfat 0,2 gr.
B. METODE
1. Preparasi Nanas
· Nanas dikupas, dipotong.
· Dimasukan kedalam toples yang telah berisi akuades 400 mL dan gula 10%.
· Toples ditutup dengan kain kasa, dan dibiarkan selama ± 3 hari.
· Nanas dibiarkan terfermentasi secara alami.
2. Isolasi Acetobacter sp. Dari nanas yang telah terfermentasi
a. Nanas yang telah mengalami fermentasi secara alami diswab kemudian diencerkan samapai 10-4 dengan akuades.
b. Masing-masing pengenceran diambil sebanyak 1 mL dan dimasukan ke dalam media HS.
c. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 30oC.
3. pembuatan kultur murni Acetobacter sp.
a. Pilih salah satu koloni tunggal yang memiliki karakter paling mirip dengan koloni Acetobacter sp. Kemudian memurnikan koloni yang dipilih dengan teknik streak quadrant pada media YEPDA cawan.
b. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 30oC.
4. pembuatan stok kultur murni Acetobacter sp.
a. Koloni tunggal yang didapatkan kemudian diinokulasikan pada media YEPDA miring dan dilabeli tiap isolate yang didapat.
b. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 30oC.
c. Kultur isolate disimpan pada refrigenerator pada suhu 50oC.
5. identifikasi Acetobacter sp.
a. Pengamatan bentuk koloni
1. Pengamatan bentuk koloni dapat diamati saat dilakukan kultur murni menggunakan metode streak kuadran.
2. Koloni yang terbentuk diamati bentuk, margins, ukuran, dan warna koloninya dll.
b. Pewarnaan Gram dan pengamatan morfologi sel
1. Stok isolate diambil menggunakan ose kemudian diulaskan pada object glass dan difiksasi.
2. Ditetesi dengan Crystal Violet dan ditunggu selama 60 detik lalu dicuci kering anginkan.
3. Ditetesi dengan Iodine dan ditunggu selama 60 detik lalu dicuci kering anginkan.
4. Ditetesi dengan etanol 96% sampai tetesannya bening lalu dicuci kering anginkan.
5. Diamati dengan Safranin dan ditunggu selama 45 detik lalu dicuci kering anginkan.
6. Diamati dengan mikroskop Gram positif akan berwarna biru keunguan dan Gram negatif berwarna merah.
c. Uji penggunaan Oksigen
1. Stok isolate diinokulasikan dengan teknik inokulasi tusuk pada media YEPDA semisolid.
2. Inkubasi selama 2 x 24 jam.
3. Diamati dengan koloni bakteri. Bakteri bersifat aerob bila koloni terbentuk diatas dan bersifat anaerob bila terbentuk dibawah.
d. Uji oksidase
1. Stok bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose dan diulaskan pada objek glass dan ditutup dengan tissue.
2. Ditetesi dengan reagen tetramethyl-D-phenylenediamine dihydrocloride. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna biru marun tidak melebihi 10 detik.
e. Uji katalase
1. Stok isolate diambil menggunakan ose dan diulaskan pada objeck glass.
2. Ditetesi dengan reagen H2O2.
3. Diamati dengan menggunakan mikroskop pada pembesaran 10x. Hasil positif jika terbentuk gelembung gas.
f. Uji oksidasi etanol
1. Stok isolat diinokulasikan pada media Carr.
2. Diinkubasi pada suhu 300C selama 2 x 24 jam.
3. Oksidasi ditandai dengan terjadinya perubahan warna menjadi media menjadi kuning.
4. Inkubasi ditambah selama 4 x 24 jam pada suhu 300C.
5. Terjadi overoksidasi etanol ditandai dengan kembalinya warna media menjadi warna awalnya.
g. Uji motilitas
1. Stok isolat ditanam pada media SIMA.
2. Diinkubasi pada suhu 300C selama 2 x 24 jam.
3. Diamati motilitas dari pertumbuhan bakteri yang terbentuk.
h. Uji indole
1. Bakteri uji ditumbuhkan pada media Indole sebanayk 1 ose.
2. Diinkubasi pada suhu 370C selama 2 x 24 jam.
3. Bakteri uji ditetesi Cofacs
4. Hasil positif jika terbentuk kompleks warna pink.
i. Uji penggunaan CaCO3
1. Stok isolat diinokulasikan pada media Frateur
2. Diinkubasi pada suhu 30oC selama 4 x 24 jam
3. Hasil yang didapat adalag terbentuknya zona jernih di sekitar koloni bakteri karena bakteri memanfaatkan CaCO3 sebagai sumber Karbon.
6. pengujian isolat yang didapat untuk pembentukan lapisan polisakarida atau nata.
ü Air kelapa disaring dan dipanaskan sampai mendidih.
ü Saat mendidih ditambahkan gula 2,5% dan ZA 0,25% dan Cuka 0,75%. Dihomogenkan.
ü Diangkat, dituang kedalam botol yang telah disterilisasi dan didinginkan.
ü Diinokulasikan kultur isolat yang didapat pada air kelapa yang telah ditambah gula, ZA dan cuka.
ü Diinkubasi pada suhu 30oC selama 2 minggu.
ü Diamati terbentuk tidaknya lapisan nata pada air kelapa.
7. Penentuan Spesies Media Pendekatan Homologi
Menentukan persen homologi dengan rumus:
%Homologi = X 100%
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL
1. Gambar Isolasi Acetobakter sp.
2. Gambar Hasil Kultur Murni Acetobacter sp.
3. Gambar Hasil Stok Kultur Murni Acetobacter sp.
4. Gambar Identifikasi Acetobacter sp.
Hasil dari pengujian
| Hasil Pengujian Acetobacter sp. | |||
| No | Uji yang dilakukan | Bakteri uji | Hasil |
| 1 | Pewarnaan Gram | Acetobacter sp. | + |
| 2 | Uji penggunaan O2 | Acetobacter sp. | + |
| 3 | Uji Oksidase | Acetobacter sp. | + |
| 4 | Uji Katalase | Acetobacter sp. | + |
| 5 | Uji Oksidasi Etanol | Acetobacter sp. | - |
| 6 | Uji Motilitas | Acetobacter sp. | + |
| 7 | Uji Indole | Acetobacter sp. | + |
| 8 | Uji CaCO3 | Acetobacter sp. | - |
Hasil Pengamatan bentuk Koloni
| Ukuran | moderat |
| Bentuk | circular |
| Elevasi | raised |
| Permukaan | kasar |
| Margins | entire |
| Karakteristik | opaque |
B. PEMBAHASAN
Hasil yang kelompok kami dapat adalah seperti dalam tabel, tetapi ada perbedaan dari beberapa referensi dengan hasil uji kelompok kami. Bakteri Acetobacter sp. trmasuk bakteri Gram negatif, hidupnya bersifat aerob obligat, tidak melalukan fermentasi alkohol, berbentuk bulat lonjong sampai batang pendek. Tumbuh baik pada pH 3,5-4,3 dan suhu 25-30oC, dapat mengoksidase etanol dan menghasilkan asam asetat dan mempunyai kemampuan overoksidizer yaitu kemampuan merubah asam asetat menjadi CO2 dan H2O dalam media, apabila gula dalam media fermentasi telah habis (Mandel, 2004). Metabolismenya menghasilkan enzim katalase (Ley and Frateur, 1974). Untuk uji indole hasilnya adalah positif dimana terbentuk warna merah pada larutan lapisan reagen. Dan uji CaCO3 seharusnya positif karena media Frateur merupakan media murni bagi Acetobacter sp (Maal et al, 2010).
Dari perhitungan %Homologi jenis bekteri yang paling mendekati adalah Acetobacter aceti yaitu 62,5%. Dan dari uji-uji yang dilakukan hasilnya hampir sama dengan kriterian atau hasil yang didapat oleh Acetobacter aceti (Maal et al, 2009).
Acetobacter adalah sebuah genus bakteri penghasil asam asetat, ditandai dengan kemampuannya mengubah etanol (alkohol) menjadi asam asetat (asam cuka) dengan bantuan udara. Ada beberapa bakteri dari golongan lain yang mampu menghasilkan asam asetat dalam kondisi tertentu, namun semua anggota genus Acetobacter dikenal memiliki kemampuan ini. Bakteri-bakteri Acetobacter dikenal penting secara komersial, antara lain karena dapat digunakan dalam produksi cuka (dengan sengaja mengubah etanol pada anggur menjadi asam asetat namun dapat juga merusak anggur, dengan menghasilkan asam asetat atau etil asetat, yang merusak rasa anggur tersebut. Pertumbuhan Acetobacter pada anggur dapat dicegah dengan sanitasi yang efektif, pemisahan udara dari anggur secara sempurna, maupun penggunaan secukupnya sulfur dioksida sebagai pengawet pada anggur. Di laboratorium, Acetobacter dikenali dengan mudah dengan pertumbuhan koloninya di medium yang mengandung 7% etanol, dan ditambahi kalsium karbonat secukupnya untuk memburamkan medium sebagian. Ketika koloni tersebut membentuk asam asetat yang cukup, kalsium karbonat kemudian melarut sehingga terbentuk daerah bening yang jelas pada medium (Madigan and Martinko, 2005).
Enumerasi dan Isolasi Acetobacter sp.
Seperti dijelaskan di atas kelompok Acetobacter dapat ditemukan pada buah-buahan yang mengalami pembusukan seperti anggur, kurma, kelapa bahkan nanas dan juga beberapa menggunakan dari produksi vinegar dari beberapa jenis substrat (Mall, 2009). Tetapi pada praktikum ini kami mengunkan nanas. Nanas memiliki rasa yang khas, manis, segar, mengandung gula, vitamin dan mineral yang diperlukan oleh tubuh (Mulyohardjo, 1984). Pada kulit buah nanas juga mengandung sukrosa, riboflavin, thiamin dan beragam mineral (Hulme, 1971) dan A. xylinum juga bnyak terdapat pada buah nanas, karena bakteri tersebut dapat tumbuh baik pada media yang mengandung sukrosa sebagai sumber energi (Lapuz et al, 1967).
Preparasi sampel ini mengunkan nanas, nanas dikupas kemudian di belah atau dipotong-potong. Selanjutnya nanas di masukan kedalam toples yang berisi gula dan akuades, ditutup menggunkan kain kasa dan dibiarkan mengalami fermentasi secara alami. Pada proses ini gula digunakan sebagai sumber karbon dan paling banyak dibutuhkan pada saat fase pertumbuhan (Gaman and Sherrington, 1994). Penutupan digunakan kain kasa bertujuan memberikan oksigen kedalam toples karena sifat bakteri tersebut aerob obligat yang artinya dapat tumbuh optimal dengan adanya oksigen (Holt et al, 1974).
Selanjutnya adalah isolasi Acetobacter yaitu diambil 1 mL cairan nanas dicampurkan dengan 9 mL akuades steril, kemudian dilakukan pengenceran hingga mencapai pengenceran 10-4. Dari pengeceran 10-1sampai dengan 10-4 suspensi diambil diambil 0,1 mL dan diinokulasikan kedalam media Herstin-Schramm dilanjutkan dengan inkubasi. Isolasi ini bertujuan untuk mendapatkan kultur murni.
Untuk identifikasi sebelumnya bakteri dari hasil isolasi diambil dan di streak kuadran pada media YEPDA cawan dan diambil dari pengenceran 10-4. Dilanjutkan dengan inkubasi. Pada proses ini bakteri yang dihasilkan sebelum dilakukan identifikasi biasanya bakteri dibuat persediaan stok kultur murni, tetapi yang paling utama adalah diamati bentuk koloninya. Selanjutnya dilanjutkan dengan beberapa uji untuk memperkuat dari identifikasi Acetobacter sp. tersebut.
Identifikasi Acetobacter sp.
Untuk melakukan identifikasi dilakukan beberapa uji yaitu uji pewarnaan Gram, uji penggunaan O2, uji katalase, uji oksidase, uji oksidasi etanol, uji CaCO3, uji motilitas dan uji indole.
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, ulasan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya ((Madigan and Martinko, 2005). Hasil yang didapat adalah Gram positif.
Uji penggunaan O2
Faktor lingkungan yang paling sensitif dan berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroorganisme khususnya bakteri adalah keberadaan Oksigen. Contohnya, beberapa mikroorganisme dapat tumbuh hanya jika ada O2 yang disebut aerob obligat. Fakultatif anaerob dapat tumbuh jika tidak ada O2 tetapi dapat tumbuh lebih baik bila ada O2. Anaerob obligat dapat tumbuh tanpa menggunakan O2, sedangkan mikroorganisme yang membutuhkan sedikit O2 disebut mikroaerofilik.
Berdasarkan hasil pengamatan diperoleh bahwa bakteri yang diujikan tumbuh pada permukaan medium. Oleh karena itu, bakteri yang diuji bersifat fakultatif anaerob. Hal ini sesuai dengan pustaka bahwa bakteri spesies Acetobacter sp. memiliki sifat fakultatif anaerob (Paco et al., 2003).
Uji Oksidase
Uji oksidase menunjukan hasil yang positif, padahal seharunya negatif. Karena begitu reagen ditetesi tidak terjadi perubahan warna dalam waktu kurang dari 10 detik menjadi biru marun. Dikarenakan Acetobacter tidak mengadung oksidase meskipun dilakukan uji lanjutan dan hasilnya menjadi ciri dari Acetobakter termasuk bakteri oksidase negatif (Maal, 2010).
Uji Katalase
Katalase merupakan enzim yang mengandung besi yang dapat menguraikan hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen. Hidrogen peroksida dibentuk bakteri aerobik selama metabolisme aerobik. Uji katalase bertujuan untuk mengetahui perbedaan kuantitas oksigen yang dilepaskan, diduga berkaitan dengan tebal tipisnya selaput lendir yang menyelimuti permukaan sel. Tebal tipisnya selaput lendir akan mempengaruhi penetrasi H2O2 ke dalam sel. Isolat yang diperoleh berdasarkan praktikum menunjukkan sifat katalase negatif yaitu ditandai dengan tidak terbentuknya gelembung gas. Hal ini sesuai dengan pernyataan Lengkey et al. (2009) juga menyebutkan bahwa Acetobacter bersifat katalase positif. Katalase mengkatalis pemecahan H2O2 membebaskan oksigen sebagai gas dengan persamaan reaksi sebagai berikut:
2H2O2 2H2O + O2
Mikroorganisme yang menghasilkan hidrogen peroksida, akumulasi senyawa tersebut menyebabkan kematian organisme kecuali kalau organisme tersebut mampu mendegradasi secara enzimatis. Senyawa ini dihasilkan ketika organismeaerob, anaerob fakultatif dan mikroaerofilik menggunakan jalur respirasi aerob dimana O2 merupakan aseptor elektron terakhir, selama degradasi karbohidrat untuk produksi energi (Lay,1993). Proses respirasi dihasilkan H2O dan O2 yang menerima dua pasang elektron dan NADH. Kadang-kadang elektron diterima oleh oksigen kurang dari dua pasang yang akan menghasilkan anion superoksidasi dari hiodrogen peroksida dalam jumlah kecil.
e- H2O- O2
O2 O2- H H2O H2O2
Anion radikal hidrogen peroksida
superoksida hidroperoksil
O2- + O2- 2H+ H2O2 + O2
Superoksida
H2O2 + H2O2 dismutase 2H2O + O2
Katalase
Uji Oksidasi Etanol
Penggunaan media Carr dalam uji oksidasi etanol dengan komposisi seperti diatas dimana setelah inkubasi 2 x 24 jam atau 48 jam media akan menunjukan perubahan menjadi kuning ini menandakan bakteri isolat memproduksi asam asetat (Maal, 2009). Dan apabila inkubasi dilanjutkan atau ditambah 4 x 24 jam bakteri ini ini akan menunjukan overoksidizer yaitu kemampuan merubah asam asetat menjadi CO2 dan H2O (Mandel, 2004). Hasil dari kelompok kami adalah negatif.
Uji Motilitas
Uji motilitas yang dilakukan pada praktikum menunjukkan hasil yang positif untuk bakteri uji, dari hasil ini diketahui bahwa bakteri uji mempunyai kemampuan untuk motil. Pengamatan motilitas bakteri di dalam suspensi cairan digunakan khusus untuk bakteria yang dikulturkan dalam media broth karena tidak dapat tumbuh dengan baik pada media padat (agar). Hasil pengamatan berbeda dengan pustaka. Menurut Lengkey et al. (2009), bakteri asam cuka golongan Acetobacter memiliki ciri motil. Oleh karena itu, bakteri yang diuji ini kemungkinan adalah bukan spesies Acetobacter melainkan bakteri asam cuka lainnya.
Uji Indole
Pada prngujian indole hasil yang didapat adalah positif dengan terbentuknya cincin berwarna pink. Pada pengujian dengan reagen Kovacs, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah pada lapisan larutan reagen. Pada pengujian dengan reagen Erhlich, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah ungu dibawah lapisan eter. Pada pengujian dengan reagen Salkowski, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah pada media, sedangkan Pada pengujian dengan reagen Coles dan Onslow, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah ungu pada kapas penutup tabung reaksi (Barrow et al, 1993).
Uji CaCO3
Uji CaCO3 yang dihasilkan oleh kelompok kami adalah negatif dan ditemukan belatung pada media. Uji CaCO3 mengunakan media frateur yang mengandung CaCO3 sebanyak 20 gr, dimana CaCO3 ini berfungsi sebagai sumber karbon bagi bakteri tersebut. Pemanfaatan CaCO3 sebagai sumber karbon oleh bakteri ditandai dengan terbentuknya zona jernih disekitar koloni bakteri (Maal et al, 2010).
Pembuatan Nata de Coco
Nata de Coco berasal dari bahasa spanyol yang berarti krim. Nata diterjemahkan ke dalam bahasa latin sebagai ³natare´ yang berarti terapung-apung. Nata dapat dibuat dari air kelapa, santan kelapa, tetes tebu (molases), limbah cair tebu, atau sari buah nanas melon, pisang, jeruk, jambu biji, strawberry. Nata yang dibuat dari air kelapa disebut nata de coco (Anonim, 2007)
Beberapa tahap kegiatan dalam pembuatan nota terdiri dari tiga tahap yaitu tahap preparasi, tahap inokulasi, fermentasi, dan pengendalianya, serta tahap permanen dan pasca fermentasi. Tahap preparasi terdiri dari: penyaringan, penambahan gula pasir dan amonium sulfat (ZA), perebusan, penambahan cuka, pendinginan. Penyaringan dilakukan untuk memisahkan kotoran-kotoran atau benda-bendaasing yang tercampur dengan air kelapa, seperti misalnya sisa sabut. Penambahan gula pasir dan ZA dapat saat air kelapa
dipanaskan, ambil larutkan hingga merata. Homogenitas larutan ini juga sangat menentukan kualitas nata yang dihasilkan. Perebusan dilakukan dengan menggunakan dandang. Setelah mendidih, rebusan pertahankan selama 5-10 menit, untuk meyakinkan bahwa mikrobia kontaminasi bahan mati. Pendinnginan paling baik dilakukan dengan cara membiarkan cairan dalam nampan selama satu malam. Hal ini sekaligus untuk mengecek ada tidaknya kontaminasi yang tumbuh pada cairan. Setelah dingin cairan tersebut diberi bibit nata (Pambayun, 2002).
Pemberian bibit atau inokulasi dilakukan apabila campuran air kelapa, gula, ZA, dan asam sulfat telah benar-benar menjadi dingin. Bila pemberian bibit dilakukan pada waktu cairan air kelapa masih dalam keadaan panas atau hangat, maka bibit akan mengalami kematian. Fermentasi adalah suatu proses pengubahan senyawa yang terkandung didalam abstrak oleh mikroba, misalnya senyawa gula menjadi bentuk lain, baik merupakan proses memecahkan maupun proses pembentukan dalam situasi aerob maupun anaerob. Jadi proses fermentasi dapat terjadi proses katabolisme maupun
anabolisme (Misaryarta 2007).
Acetobacter yang biasanya banyak digunakan dalam produksi nata adalah A. xylinum . A. xylinum adalah bakteri yang memiliki kemampuan menghasilkan Nata de Coco. Nata de Coco merupakan selulosa yang menjerap air sehingga tampak seperti jelli yang kompak, kenyal, jernih. Nata de Coco banyak dikonsumsi sebagai makananpencuci mulut (desert) dan sebagai makanan diet rendah kalori (Seumahu et al, 2005). Nata yang dihasilkan boleh dibilang gagal ini dikarenakan pada setelah penuangan nata mengalami goncangan.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A . KESIMPULAN
Dari pembahasan di atas dapat ditarik kesimpulan bahwa:
1. Pendekatan mikrobiologis yang digunakan untuk identifikasi Acetobacter sp. adalah pewarnaan Gram, uji indole, uji penggunaan oksige, uji katalase, uji oksidase, uji motilitas, uji oksidasi etanol dan uji CaCO3.
2. Karakteristis dari Acetobacter sp. termasuk bakteri Gram negatif, hidupnya bersifat aerob obligat, tidak melalukan fermentasi alkohol, berbentuk bulat lonjong sampai batang pendek . Tumbuh baik pada pH 3,5-4,3 dan suhu 25-30oC, dapat mengoksidase etanol dan menghasilkan asam asetat dan mempunyai kemampuan overoksidizer yaitu kemampuan merubah asam asetat menjadi CO2 dan H2O dalam media, apabila gula dalam media fermentasi telah habis. Metabolismenya menghasilkan enzim katalase . Untuk uji indole hasilnya adalah positif dimana terbentuk warna merah pada larutan lapisan reagen. Dan uji CaCO3 seharusnya positif karena media Frateur merupakan media murni bagi Acetobacter sp.
3. Acetobacter yang dihasilkan adalah jenis Acetobacter aceti dengan nilai Homologi 62,5%.
B. SARAN
Perlu kehati-hatian dan ketelitian dalam melakukan perlakuan sehingga didapat hasil yang sesuai dengan referensi yang ada, begitu juga tingkat sterilisasi perlu diperhatikan agar perlakuan tidak mengalami kontaminan. Dan juga dalam perlakuan pembuatan nata usahakan mengikuti perlakuan yang sesuai dan benar.
V. DAFTAR PUSTAKA
Barrow, G.I. and Feltham, R.K.A. 1993. Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bakteria “Third Edition”. Australia: Cambridge University Press.
Effendi, M.S. 2002. Kinetika Fermentasi Asam Asetat (Vinegar) oleh Bakteri Acetobacter B 127 dari Etanol Hasil Fermentasi Limbah Cair Pulp Kakao. Peneliti dan staf pengajar Fakultas Teknik Jurusan Teknologi Pangan Universitas Pasundan.
Gaman, P.M. dan Sherrington, K.B. 1981. Pengantar Ilmu Pangan Nutrisi dan Mikrobiologi. Yogyakarta: Gadjahmada Universyti Press.
Hidayat, N. 2010. Isolasi Bakteri Asam Asetat Penghasil Selulosa. http://permimalang.wordpress.com/2010/10/19/Isolasi-bakteri-asam-asetat-penghasilselulosa. diakses tanggal 16 Desember 2010.
Holt, J.G, Krieg, N.R., Peter, H.A., Jame, S., and William, T. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. http://foamykumbucha.com/14_html diakses 16 Desember 2010.
Hulme,A.C. 1971. The Biochemistry of Fruits and Their Pruducts. Vol. 2. Academic. Press. London.
Kadere1, T.T., Miyamoto, T., Oniang`o1, R.K., Kutima1, P.M. and Njoroge1, S.M. 2008. Isolation and identification of the genera Acetobacter and Gluconobacter in coconut toddy (mnazi). Department of Food Science and Technology, Jomo Kenyatta University of Agriculture and Technology (JKUAT), P.O. Box 62000, Nairobi. Animal Food Functions Laboratory, Faculty of Agriculture, Okayama University, Japan.
Ketchum, P. A. 1984. Microbiology. John wiley & sons, USA.
Lancaster, M. 2002. Green Chemistry, an Introductory Text, Cambridge: Royal Society of Chemistry).
Lapuz, M.M., Golardo, E.G., & Palo, M.A. 1967. The Organism – Culture Requirements. Characteristics and Identity. The Philippine J. Science. The AVI Publishing Company, Inc. Conecticut.
Lay, B. W. 1993. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada.
Lengkey, H. A. W., R. L. Balia, I. Togoe, B. A. Tasbac, M. Ludong. 2009. Isolation and identification of acetic acid bacteria from raw poultry meat. Biotechnology in Animal Husbandry. 25 (5-6) : 1071-1077.
Ley,J.D. and Frateur, J. 1974. Genus Acetobacter. Bejering. 1889:126-277. Dalam R.E, Buchanan dan N.E. Gibson (Ed) Bergeye’s Manual of Determinatif Bacteriology, eight Edition. The Williams and Wilkins Co. Baltimore.
Madigan, MT; Martinko J; Parker J (2005). Brock Biology of Microorganisms (edisi ke-10th Edition). Lippincott Williams & Wilkins.
Maal, K.B. and Shafiee, R. 2009. Isolation and Identification of an Acetobacter Strain from Iranian White-Red Cherry with High Acetic Acid Productivity as a Potential Strain for Cherry Vinegar Production in Food and Agriculture Biotechnology. World Academy of Science, Engineering and Technology. Iran.
Maal, K.B., Shafiee, R. and Kabiri, N. 2010. Production of Apricot Vinegar Using an Isolated Acetobacter Strain from Iranian Apricot. World Academy of Science, Engineering and Technology. Iran.
Mendel, J.H. 2001 Efek Penambahan Gula dan Perbedaan Asal Inokulum terhadap Tebal dan Berat Pelikel Nata pada Pembuatan Nata de Coco. Majalah Ilmiah BIMN Edisi 6.
Misgiyarta. 2002. Teknologi Pembuatan Nata de coco. http://www.pustaka-deptari.go.id diakses tanggal 16 Desember 2010.
Muljohardjo, M. 1984. Nanas dan Teknologi Pengolahannya. Liberty. Yogyakarta.
Pambayun, Rindik. 2002. Teknologi Penggolongan Nata de coco.Kanisius. Yogyakarta
Paco, R. S., I. L. Leme, J. A. Bottino, dan A. J. P. Ferreira. 2003. Identification of Acetobacter spp. From Broiler Litter in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology. 34 : 236-237.
Ryandini, D., H. Pramono, Sukanto. 2005 Mikrobiologi Industri. UNSOED, Purwokerto.
Seumaha, C.A., Suwanto, A., dan Suhartono, M.T. 2005. Dinamika Populasi Acetobacter Selama Proses Nata de Coco. Jumal Mikrobiologi Indonesia. FMIPA, Universitas Pattimura, Ja1an Ir. M. Putuhena, Kampus Poka, Ambon 97233.
Tannock, G. W., A. Tilsala-Timisjarvi, S. Rodtong, J. NG, K. Munro, dan T. Alatosssava. 1999. Identification of Lactobacillus Isolates from the Gastrointestinal Tract, Silage, and Yoghurt by 16S-23S rRNA Gene Intergenic Spacer Region Sequence Comparisons. Applied and Environmental Microbiology. 65 (9) : 4264 – 4267.
Tressler, D.R., & Joslyn, M.A. 1971. Fruit and Vegetable Juice Processing Technology.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar